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小鼠线粒体探针法荧光定量PCR试剂盒通用原则

2024/6/19 10:13:26发布54次查看
小鼠线粒体探针法荧光定量pcr试剂盒通用原则:
1,先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。
2, 扩增子的长度应不超过400bp,理想的能在100-150bp内,扩增片断约短,有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性
3, 保持gc含量在20%和80%之间,gc富含区容易产生非特异反应,从而会导致扩增效率的降低,及在sg分析中非特异信号。
4, 为了保证效率和重复性,应避免重复的核苷酸序列,尤其是g(不能有4个连续的g)
5, 将引物和探针互相进行配对检测,以避免二聚体和发卡结构的形成。
b),探针设计指导
1,在设计引物之前设计探针
2,探针的tm值应在68-70℃之间,如果是目测探针,则要仔细审查gc富含区。
3,探针的5’端要避免有鸟氨酸,5’g会有淬灭作用,即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在
4,选择c多于g的链作探针,g的含量多于c会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。
6, 探针应尽可能的短,不要超过30个bp。
7, 检测探针的dna折叠和二级结构。
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